非洲猪瘟病毒里 基因“针线”绣功了得

综合科技日报、iNature、复旦大学生命科学学院

非洲猪瘟100%的致死率令养殖场措手不及，侵入猪身体里的病毒为什么可以长驱直入？有没有什么办法能够阻止它的入侵呢？

近日，国际知名学术期刊《自然·通讯》(Nature Communications) 在线发表了复旦大学生命科学学院遗传工程国家重点实验室甘建华课题组与李继喜课题组合作的关于非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）来源的DNA连接酶（AsfvDNAL）的研究成果。该研究用X-射线晶体学方法解析了AsfvDNAL与不同类型DNA复合物的结构，揭示了AsfvDNAL结合和催化底物连接的分子机制，为针对非洲猪瘟病毒DNA修复通路蛋白的药物设计提供了结构基础。

非洲猪瘟病毒具有传染性，可引起猪的高致命性疾病。ASFV DNA连接酶是迄今为止发现的最易出错的连接酶之一，它催化ASFV DNA修复过程中的DNA连接反应，在病毒基因组的诱变中起着重要作用。

1月23日，复旦大学甘建华,李继喜及四川大学/佐治亚州立大学Huang Zhen共同通讯等在Nature Communications 上发表题为“Structure of the error-prone DNA ligase of African swine fever virus identifies critical activesite residues”的文章，报道了四个独特的活性位点残基(AD结构域的Asn 153和Leu 211；OB结构域的Leu 402和Gln 403)对AsfvLIG的催化效率至关重要。

非洲猪瘟病毒(ASFV)是一种双链DNA病毒，具有高度的传染性，可在家猪和野猪中引起致命的疾病。ASFV基因组的大小在170到190 kb之间，编码150多个蛋白质，这些蛋白质参与了ASFV生命周期的各个阶段，包括基因表达、DNA复制、病毒组装、进入宿主细胞和抑制宿主免疫应答。AsfvLIG由419个氨基酸组成，是迄今发现的最小的DNA连接酶之一。AsfvLIG在中心有一个腺苷化结构域(AD)，在C端有一个OB折叠结构域(OB)；AD和OB结构域在同源蛋白中都是保守的。除了AD和OB结构域外，许多DNA连接酶都有一个DNA结合域(DBD)，这对于底物结合和连接过程至关重要，而AsfvLIG的N端区域(NTD)与其他连接酶DBD结构域没有相似之处。

AsfvLIG的结构示意图

AsfvLIG包含四个独特的残基，包括AD域的Asn 153和Leu 211，以及OB结构域的Leu 402和Gln 403。虽然他们不参与直接催化过程，这些残基可能与其相应的NTD或DBD结构域协同工作，这些位点残基对缺口的识别和催化效率有着重要的意义。

该文章发现的4种独特的结构特征可以作为小分子设计的潜在靶点，这可能会损害ASFV的基因组修复，并有助于今后对抗这种病毒。

该项目得到了国家自然科学基金和中国重点研发项目，四川省重点研发项目资助项目。

断尾求生，病毒躲过宿主免疫系统

“人们会发现，患了猪瘟的病猪会发生脾脏肿大，脾脏是重要的免疫器官，那说明它的免疫系统‘奋力作战’了。”李继喜说，但是非洲猪瘟病毒很聪明，在进入体内后会不断变化，让免疫系统“抓不到”。

它的变化很像壁虎的“断尾求生”。“对于宿主免疫系统要攻击的DNA片段，它会剪切掉，然后再重新‘长出来’。”李继喜说。“长出来”意味着DNA的延长、重组，这个过程需要两种DNA聚合酶(X和P)和一种DNA连接酶。

“有这3种酶参与的整个过程形成了一套完整的DNA修复通路。”李继喜说，团队已经解出了其中的一种聚合酶，文章2017年发表，揭示了聚合酶X拥有一个独特的磷酸根识别位点；另一种聚合酶的研究已经收尾，正在进行结果整理和论文编写工作，至此团队已经“全面打通”整个通路的关键节点。

病毒更狡猾的地方在于它新长出来的DNA片段和原来的不同，使得宿主体内的免疫系统措手不及，难以锁定攻击目标。非洲猪瘟病毒也是如此，其基因组修复时会发生突变，让免疫系统无法精准识别，进而使得针对它们的狙击，无法奏效。

分辨率高，晶体法定格“绣娘”手法

俗话说，“万变不离其宗”。既然病毒DNA修复时有千变万化，有没有可能找到所谓的“宗”即保守区呢？

这就要对关键酶进行高精度的结构解析。团队选择了X-射线晶体学方法，与声名鹊起的冷冻电镜方法相比，前者的分辨率更高，且一旦摸索好条件后，更易重复。

结晶条件的摸索却是非常艰难的过程。“我们用基因工程的方法，让非洲猪瘟病毒的连接酶在工程菌中大量表达，通过纯化柱等方法将蛋白纯化出来。”李继喜说。这个时候目标蛋白还在溶液中，与同自己性质、分子量相近的“兄弟姐妹”在一起。

团队进行了上千次相关参数的摸索，最终得到了均一性高的完美晶型，通过X光衍射、三维重构等方法，获得了分辨率达到2.5埃的连接酶分子结构。

在超高分辨率下，科学家可以看到蛋白质中每个氨基酸单体的相互作用、电子密度云的情况，目击氢键间的相互连接，从而判断和预测作为“绣娘”的DNA连接酶将用哪些可能的针法将什么样的DNA片段连接起来。

亲见“凹造型”，锁定药物设计潜力点

预测之后，必须亲见。利用X-射线晶体学方法获取酶与DNA作用的“影像”，将对酶与底物相互作用时的“凹造型”一目了然。

为此，根据已经获得的连接酶分子结构，参考相关文献，团队设计了10几种可能的DNA片段，试试连接酶的“功力”。“DNA片段有长有短，含有的碱基对数量8到20个不等。”李继喜说。

对于这些不同的DNA底物分子，连接酶表现了不同的活性。从本质上说，它们之间的反应是酶促反应。分析发现，非洲猪瘟病毒连接酶在底物催化位点附近具有一些明显不同的氨基酸组成。蛋白突变、体外DNA结合以及活性研究显示，催化位点附近的氨基酸对其与DNA形成复合物及活性至关重要。

李继喜解释道：“单独的酶的构象可以想象成一个三节棍，当和DNA作用时，这个三节棍的三段会发生变化，收拢到一起形成一个‘口袋’状，把DNA关在里面，促成DNA连接反应的进行。”

高分辨率结构显示，该连接酶在N-端具有一个独特的DNA结合结构域(NTD)，该结构域对底物结合十分重要。

“这就好比‘口袋’入口的地方有个把门的，这个独特的结合结构域‘认可’了，才能被连接酶纳入到口袋中，促进DNA的反应，如果这个‘把门’的不同意，就无法进行DNA的‘缝合’工作。”李继喜说。

可以针对这个独特的位点设计药物，阻断连接酶的工作，进而掌握抑制病毒的方法。“已有研究发现病毒的成熟颗粒中含有连接酶，也就是说病毒已经进入了宿主细胞，并进行了翻译和组装之后，才会启动连接酶的翻译工作。”李继喜说，因此以该位点为靶点的药物并不能预防非洲猪瘟的感染，而是对猪瘟进行治疗。目前，该团队已经开始与北大团队合作开启化合物的筛选工作。