童光志：再度流行的伪狂犬病毒：有何变异？

2018年6月11日，由国际猪兽医学会、中国畜牧兽医学会、中国农业大学共同主办的第二十五届国际猪病大会在（中国）重庆隆重开幕，这是自国际猪病大会由国际猪兽医学会于1969年创立并传承至今的50年以来首次在中国召开。

IPVS2018 会期持续4天，哼哼会将在会议现场为广大养猪朋友带来最新听课笔记和解读。

再度流行的伪狂犬病毒：有何变异？

童光志 研究员 中国农业科学院上海兽医研究所所长

童光志，现任中国农业科学院上海兽医研究所所长， 研究员，博士生导师，国务院政府特殊津贴获得者，“百千万人才工程”28人之一，兽医生物技术国家重点实验室主任，中国农业科学院跨世纪学科带头人，主持“863”、“973”、国家自然科学基金近30项科研课题。

2018年6月13日上午，童光志教授对参加IPVS的与会者介绍了他近十年来在伪狂犬方面的最新研究成果。他通过两个假说，向我们解读了为什么从2011年起我国的PRV病毒会再度大规模流行。

童教授首先介绍了伪狂犬病毒的背景信息：

正如我们所知道的，猪是伪狂犬病毒自然感染宿主，且只有一个血清型。PRV对猪的不同生长阶段均有影响且呈现不同的临床症状，如后备母猪表现为繁殖障碍，公猪表现为不育，小猪出现神经症状和死亡，育肥猪出现呼吸道症状、生长缓慢和潜伏感染。

不同类型的PRV病毒（强毒株、弱毒株和基因缺失毒株）均能感染猪且终生带毒。PRV主要的靶器官是三叉神经和扁桃体，感染PRV的机体会出现免疫抑制性现象，并能继发感染其他疾病，潜伏的PRV是主要的传染源且导致猪场出现循环传播现象。

目前发达国家（欧洲和北美洲）主要采用DIVA策略对PRV实施根除，DIVA策略即猪场大规模的免疫gE缺失疫苗，通过监测gE抗体，淘汰gE抗体阳性的猪只，从而彻底净化PRV。

图 PRV的根除策略

20世纪50年代，中国爆发PRV；70年代，gE缺失疫苗—Bartha-K61诞生；1990年到2011年，80%的猪群免疫Bartha-K61疫苗，伪狂犬在中国得到控制但没有根除。

童教授以两个推论解释了导致PRV在我国的饲养猪群中根除失败的原因： 

推论一  变异型PRV可能是伪狂犬再度流行的主要原因

童教授于2011年首次发现：

1.从2011年开始，部分PRV阴性的猪场在几个月内突然出现gE抗体转阳，且野毒阳性率可达50%或更高的水平；

2. 在一些疫苗免疫的猪场，母猪仍然出现流产、产弱仔、新生仔猪出现神经症状；

3. 感染猪只出现典型的颤抖、跛行和角弓反张等临床症状且高达50%的死亡率。

图 PRV阴性场gE抗体转阳率

童教授从这些免疫过Bartha-K61疫苗且出现流产现象的样本中分离到JS-2012，通过细胞实验发现，JS-2012与Bartha-K61相比较，JS-2012的毒力更强，能导致细胞产生更严重的病变。

图 JS-2012与Bartha-K61细胞实验

攻毒实验：首先对母猪进行Bartha-K61疫苗免疫，对所产仔猪于14日龄分别用 10⁴ TCID₅₀/2ml的 JS-2012毒株和 10⁶ TCID₅₀/2ml的SC毒株（1980年从中国分离毒株，伪狂犬经典毒株）进行攻毒，结果表明，10⁴ TCID₅₀/2ml的 JS-2012攻毒组的猪群体温比SC攻毒组高，这说明，母源抗体不能提供针对变异株伪狂犬完全的保护，也表明JS-2012株有更强的毒力。

为更进一步确认PRV变异株与疫苗株Bartha-K61有什么不同，童教授对两者之间进行序列比对。结果发现，PRV变异株存在很多氨基酸变异，同时对gC全基因组测序，结果显示，与Bartha-K61相比，gC基因存在很多的基因插入与缺失。该变异的PRV仍为中国PRV基因2型（欧洲和其他国家为基因1型），为我国独立演化的毒株。

图 gC基因全基因组分析

在PRV变异毒株毒力增强的同时，其致病性是否与毒力一致？童教授分别用10⁶ TCID₅₀2ml的 JS-2012毒株和 10⁶ TCID₅₀/2ml的SC毒株对14日龄仔猪攻毒，攻毒方法采用滴鼻和肌肉注射，结果显示，同一剂量的JS-2012毒株对14日龄致病性高于SC毒株，且鼻内攻毒的实验动物死亡更快（5天内死亡）。而不同剂量的毒株攻毒实验也表明，JS-2012毒株具有更高的致病性。相比于SC毒株，JS-2012毒株对各个生长阶段的猪群具有更高的致病性，因此变异型PRV可能是伪狂犬再度流行的主要因素。

图 10⁴ TCID₅₀ SJ-2012株和10⁶ TCID₅₀ SC株的攻毒实验

 推论二  免疫原性的改变导致PRV的再度流行？

10头7周龄仔猪，免疫Bucharest和Bartha-K61，免疫后，分别收集2周、3周、4周的血清，阴性对照用DMEM免疫，评估4种PRV毒株（Bucharest、Bartha-K61、SC、JS-2012）的中和抗体，结果表明，Bucharest和Bartha-K61的免疫血清分别能特异性的中和相应的毒株。而以上两种免疫血清对JS-2012毒株交叉中和能力较差（中和抗体滴度比Bartha-K61低3-7倍）。

通过以上结果我们可以发现，目前的疫苗不能有效预防JS-2012变异毒株引起的伪狂犬病，那么是什么原因导致PRV变异毒株的毒力增强？童教授对PRV重要保护性抗原gB糖蛋白进行分析。

运用Crisp-cas9 技术，将JS-2012-△gE/gI与Bartha-K61的gB基因互换，构建JS-2012-△gE/gI重组毒株—JBJ和Bartha-K61基因重组毒株—BJB，即JBJ含有Bartha-K61的gB基因，BJB含有JS-2012-△gE/gI的gB基因。分别用Bartha-K61和Bucharest免疫仔猪，收集14天，21天，28天的免疫血清，对JS-2012，JS-2012-△gE/gI，JBJ，Bartha-K61，BJB交叉中和抗体实验，结果显示，BJB的中和抗体滴度高于JS-2012毒株，而低于Bartha-K61毒株。

图 PRV各毒株的交叉中和实验

小鼠的攻毒试验表明，重组毒株BJB的有效性毒力保护性高于Bartha-K61毒株，而重组毒株JBJ的有效性毒力保护性低于JS-2012-△gE/gI毒株，因此，童教授认为，gB的变异能导致PRV变异毒株的毒力增强、致病性更高。

从2011年以来，PRV再度在中国开始流行。其中2011-2015年主要影响我国北方地区，从2016年开始，伪狂犬变异株在我国南方等省份也开始大面积传播。PRV变异株在临床上对伪狂犬阴性场造成的损失最大，且导致阴性猪群迅速转阳。新南方认为，伪狂犬病毒的的传播中种猪的引入和育肥猪的散毒是两个关键的因素。建议伪狂犬疫区的猪场做如下工作：

1、加大伪狂犬疫苗的使用剂量和免疫频次，关注育肥猪的免疫；

2、重点做好监测，尤其是对新引进群体的监测，引种回来后严格隔离，间隔14天两次抽血检测是必要的；

3、适时启动净化策略。（以上内容仅为哼哼小编听课笔记，暂未经报告本人确认）

通讯员：陈家锃 廖娟红  审核：陈家锃 李增强 蔡行